整合素結合性信號分子抗體的操作步驟涉及多個關鍵環節，以下是基于相關研究的標準化流程總結：

一、樣本制備與裂解

?細胞裂解?

使用含NP-40或Triton X-100的裂解緩沖液溫和裂解細胞，確保整合素及其結合信號分子（如β-catenin、Talin等）保持完整。裂解后需離心去除不溶物，保留上清液用于后續實驗。

?預純化處理?

通過Normal IgG/微珠預純化樣品，減少非特異性結合干擾?。

二、免疫共沉淀（Co-IP）

一抗孵育

稀釋整合素信號分子一抗（如抗-FAK、Src、ILK等）于封閉液，4℃過夜或室溫2小時。

（建議濃度參考說明書，通常1:100-1:500）

PBS漂洗3次，每次5分鐘。

二抗孵育

熒光標記二抗（如Alexa Fluor 488/594）避光室溫孵育1小時，PBS沖洗3次。

（若需核染色，可加入DAPI孵育5分鐘）

?洗滌與洗脫?

用裂解緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結合蛋白，最后用低pH洗脫液或SDS-PAGE上樣緩沖液解離復合物?

。

三、結果檢測與分析

封片觀察

抗淬滅封片劑（如ProLong Gold）封片，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察。

對照設置

陰性對照：省略一抗或使用同型IgG；陽性對照：已知表達靶標的樣本。

關鍵注意事項

樣本保存：固定后4℃ PBS可短期保存，長期需-20℃凍存。

抗體選擇：優先驗證過整合素通路應用的抗體（如Phospho-FAK Tyr397）。

多色實驗：確保抗體種屬來源及熒光通道不重疊。

注意事項

?抗體選擇?：需驗證抗體特異性，避免交叉反應（如使用同型對照）?。

?時間控制?：Co-IP孵育時間過長可能導致非特異性結合增加?。

?陰性對照?：設置無抗體或無關抗體組，排除背景干擾?。